隨著人們對免疫治療興趣的增長，對更好的CAR-T細(xì)胞制造工具的需求也在增長。CRISPR技術(shù)的進(jìn)步能解決這個(gè)問題嗎？
在過去的十年里，一種新的免疫治療工具進(jìn)入了臨床。被設(shè)計(jì)成表達(dá)嵌合抗原受體的T細(xì)胞，即CAR-T細(xì)胞，已經(jīng)被證明可以幫助血癌患者。2011年的一項(xiàng)關(guān)鍵研究使用第二代CAR-T細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)大多數(shù)測試患者T細(xì)胞的持續(xù)激活和緩解。
一年后出現(xiàn)了另一個(gè)重大突破，兩個(gè)小組描述了一種名為CRISPR-Cas9的新型基因編輯工具，并演示了它在真核細(xì)胞中的應(yīng)用。這兩份報(bào)告幫助開啟了基因編輯的新時(shí)代。
盡管基因編輯有可能改善細(xì)胞工程，但CAR-T細(xì)胞和CRISPR的交叉還需要幾年時(shí)間。
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尋找方法
從一開始，CAR - T細(xì)胞就顯示出了巨大的殺癌潛力，但制造這些細(xì)胞既繁瑣又復(fù)雜。
為了推進(jìn)CAR-T細(xì)胞治療，研究人員需要找到一種更有效的方法來設(shè)計(jì)長CAR序列。
CRISPR驅(qū)動CAR的發(fā)展
從一開始，CRISPR就像是制造T細(xì)胞的理想方法。這是一個(gè)簡單的過程，具有最小的脫靶效應(yīng)，適用于多種細(xì)胞類型。但CRISPR在一個(gè)領(lǐng)域遇到了困難。
CRISPR-Cas9通過產(chǎn)生靶向雙鏈DNA (dsDNA)斷裂，然后通過細(xì)胞的非同源末端連接途徑修復(fù)，從而有效地產(chǎn)生小的突變。然而，當(dāng)使用同源導(dǎo)向的修復(fù)機(jī)制插入外源DNA時(shí)，CRISPR編輯的效率可能低得可憐。然而，插入DNA對于制造CAR-T細(xì)胞至關(guān)重要。
位于奧馬哈的內(nèi)布拉斯加大學(xué)醫(yī)學(xué)中心(University of Nebraska Medical Center)的基因工程師Channabasavaiah Gurumurthy表示："Easi-CRISPR是一種更好的工具，適用于同源性導(dǎo)向修復(fù)。"
Gurumurthy和他的合作者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用CRISPR將DNA插入細(xì)胞時(shí)，長單鏈DNA (ssDNA)是比雙鏈DNA更有效的模板。使用Easi-CRISPR，長ssDNA與含有Cas9和導(dǎo)向RNA的預(yù)組裝復(fù)合物一起被注入，導(dǎo)致更高的靶標(biāo)編輯率和更低的脫靶編輯率。之前的報(bào)道顯示，化學(xué)合成的具有2-甲氧基和硫代磷酸基團(tuán)修飾的單導(dǎo)向RNA (sgRNA)增強(qiáng)了原代細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性和編輯效率。此后，CRISPR-Cas9似乎開始成為T細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生缺失和插入的有效工具。
去年，Alexander Marson、Gurumurthy和他的同事們利用Easi-CRISPR對人類T細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了重新編程，且不需要病毒載體。本研究表明，將ssDNA作為同源性導(dǎo)向的修復(fù)模板對T細(xì)胞進(jìn)行CRISPR編輯，與dsDNA模板相比，能夠更準(zhǔn)確、更有效地進(jìn)行大規(guī)模的基因插入，并且脫靶整合概率更低。
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展望未來
雖然有希望，但還有一個(gè)重要的考慮。"長ssDNA序列很難在實(shí)驗(yàn)室中產(chǎn)生，尤其是在基因編輯實(shí)驗(yàn)中需要高濃度的長ssDNA，" Marson實(shí)驗(yàn)室的成員、該研究的第一作者Theodore Roth說。
一些公司和研究開發(fā)人員正試圖解決這個(gè)問題，他們正在研究有效生成大量長ssDNA的方法?？偛课挥谛聺晌髦萜に箍ㄋf(Piscataway)的全球生物技術(shù)公司GenScript以其領(lǐng)先的DNA合成技術(shù)而聞名。該公司最近開始提供數(shù)千個(gè)核苷酸長度的ssDNA，數(shù)量可達(dá)100微克--這是使用CRISPR進(jìn)行T細(xì)胞重編程的理想選擇。GenScript也是為數(shù)不多的提供完整的CRISPR解決方案的公司之一，包括HPLC純化的、化學(xué)合成的sgRNAs，并通過末端修飾來增強(qiáng)CRISPR編輯。
基因編輯正在改變研究人員研究細(xì)胞工程的方式。像Easi-CRISPR這樣的方法，連同DNA和RNA合成的改進(jìn)，將進(jìn)一步加強(qiáng)CAR-T細(xì)胞工程的努力，最終改善癌癥治療和人類健康。（生物谷Bioon.com）
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